電融合儀BLS在豬卵母細(xì)胞孤雌激活中的應(yīng)用*

劉曉1，2 張慶橋3 潘登科2** 陳扣扣2，4 張衛(wèi)紅2，4馮沖2，4 馮書(shū)堂2

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所, 蘭州,730050；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所,北京,100094；3.河北工程大學(xué)，邯鄲，056038；4.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué),蘭州,730070)

摘要:目的 建立并優(yōu)化BLS細(xì)胞融合儀在豬孤雌胚體外生產(chǎn)中的使用條件，同時(shí)為克隆胚的生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)參考。方法 以體外成熟的豬卵母細(xì)胞為研究對(duì)象，研究了不同的電場(chǎng)強(qiáng)度、脈沖時(shí)程和脈沖次數(shù)對(duì)豬卵母細(xì)胞電激活效果及其對(duì)孤雌胚發(fā)育率的影響。結(jié)論 電激參數(shù)(1.2KV/cm 、100μs、2次脈沖)能夠得到較高的卵裂率和囊胚率(70%、30%左右)；BLS細(xì)胞融合儀是一種經(jīng)濟(jì)高效的胚胎激活儀。

關(guān)鍵詞: 豬；孤雌激活；BLS融合儀

中圖分類(lèi)號(hào)：S828.3           文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A             文章編號(hào)：

豬的解剖及生理結(jié)構(gòu)與人類(lèi)很相似，是研究人類(lèi)**的理想實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用[1-3]。小型豬以其作為異種器官移植供體的獨(dú)特優(yōu)越性，日益成為國(guó)內(nèi)外研究的新熱點(diǎn)[4]。人源化基因豬的研究和應(yīng)用對(duì)豬的胚胎生物技術(shù)中起到了積極的推動(dòng)作用，而卵母細(xì)胞的激活又是這些研究的重要環(huán)節(jié)之一。

哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞的人工激活有物理和化學(xué)的方法[5]。有報(bào)道，化學(xué)激活刺激豬卵母細(xì)胞激活率低，電激活的卵裂率明顯高于化學(xué)激活。迄今為止出生的核移植豬主要采用電激活方法獲得的。目前常用的電融合儀主要是產(chǎn)于美國(guó)、日本和澳大利亞，價(jià)格昂貴。匈牙利生產(chǎn)的一種簡(jiǎn)易便攜電融合儀BLS，專(zhuān)為哺乳動(dòng)物胚胎電融合而設(shè)計(jì)，此儀器主要應(yīng)用于生產(chǎn)小鼠四倍體胚胎，在豬的卵母細(xì)胞激活和克隆胚的融合激活中很少應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)旨在探索BLS細(xì)胞融合儀的不同電激活參數(shù)條件對(duì)豬體外成熟卵母細(xì)胞人工激活效果的影響，優(yōu)化BLS細(xì)胞融合儀在豬孤雌胚體外生產(chǎn)中的*佳條件，并為豬體細(xì)胞重構(gòu)胚胎的融合激活及四倍體制備提供一種高效設(shè)備。

1 材料和方法

1.1試驗(yàn)材料

所有化學(xué)試劑均購(gòu)自Sigma公司；卵母細(xì)胞體外成熟（IVM）以及胚胎培養(yǎng)耗材分別為NUNC，Greiner (German)公司產(chǎn)品。

1.2 主要溶液

抽卵液PVA-DPBS為無(wú)鈣的PBS緩沖并添加了0.1%(質(zhì)量體積比) 聚乙烯醇(PVA)配成；卵母細(xì)胞體外成熟（IVM）液為無(wú)BSA 的NCSU-23(North Carolina State University23)添加10%(體積比)豬卵泡液(PFF)，10 ng/mL表皮生長(zhǎng)因子(EGF)，10 IU/mL人絨毛膜促性腺**(hCG) 和10IU/mL 孕馬血清促性腺**(PMSG)；融合/激活液由0.28 mol/L 甘露醇，0.1 mmol/L 氯化鈣，0.1 mmol/L 氯化鎂，0.5 mmol/L HEPES 以及0.01%PVA組成；胚胎培養(yǎng)基為PZM + 0.3% BSA；0.1%透明質(zhì)酸酶。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 豬卵母細(xì)胞體外成熟（IVM） 從屠宰場(chǎng)取母豬卵巢，放入30-35℃含青霉素和硫酸鏈霉素的生理鹽水中，5 h 內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。用配有18G針頭的20 mL注射器抽吸卵巢上直徑3-6 mm的卵泡，經(jīng)

PVA-DPBS洗滌3遍后挑選卵丘包裹3層以上，致密且胞質(zhì)均勻的卵丘細(xì)胞-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)，

再用IVM培養(yǎng)液洗滌3遍。將洗滌好的COCs轉(zhuǎn)入IVM培養(yǎng)液中培養(yǎng)。COCs在39℃，5％CO2，100％濕度的CO2培養(yǎng)箱中成熟 20- 22h后，轉(zhuǎn)移到未添加**的IVM液中繼續(xù)培養(yǎng)20-22h，用0.1% 透明質(zhì)酸酶脫去包裹在其周?chē)穆亚鸺?xì)胞，卵周隙明顯、卵細(xì)胞膜完整且排出**極體的卵母細(xì)胞視為成熟卵母細(xì)胞。

1.3.2 卵母細(xì)胞孤雌激活  取上述脫去卵丘的MⅡ卵母細(xì)胞，用激活液洗滌3遍。再將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到已經(jīng)鋪滿激活液，電極寬度為0.5mm的融合槽中，用CF-150B（BLS）細(xì)胞融合儀以不同電場(chǎng)強(qiáng)度（1.6KV/cm、1.2KV/cm、0.8KV/cm、0.6KV/cm）、不同脈沖次數(shù)（1次、2次、3次）、不同脈沖時(shí)程（50μs、100μs、150μs）進(jìn)行誘導(dǎo)激活。洗滌后將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到PZM3 + 7.5μg/mL CB（細(xì)胞松弛素B）的液滴內(nèi)作用4h, 然后轉(zhuǎn)移到PZM3中, 48h和168h觀察胚胎的卵裂和囊胚發(fā)育情況。

注：實(shí)驗(yàn)中除被檢驗(yàn)的參數(shù)外，其他條件均保持不變。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)處理重復(fù)4次，數(shù)據(jù)結(jié)果用SAS 的ANOVA 過(guò)程進(jìn)行分析，Duncan’s 檢驗(yàn)方法判定處理間的差異顯著性，當(dāng)P < 0.05時(shí)認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)豬卵母細(xì)胞孤雌激活的影響

脈沖時(shí)程100μs、脈沖次數(shù)2次，以不同電場(chǎng)強(qiáng)度（0.6KV/cm、0.8KV/cm、1.2KV/cm、1.6KV/cm）誘導(dǎo)卵母細(xì)胞激活。隨著場(chǎng)強(qiáng)的增加，卵裂率和囊胚率升高，但在1.6KV/cm時(shí)，胚胎死亡率急劇上升，結(jié)果見(jiàn)表1。電場(chǎng)強(qiáng)度為1.2KV/cm時(shí)，卵裂率和囊胚率分別達(dá)到(72.5%、34.5%)，顯著高于其它組（P<0.05）。

表1 不同電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)豬卵母細(xì)胞孤雌激活的影響

同一欄內(nèi)上標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

2.2 脈沖次數(shù)對(duì)豬卵母細(xì)胞孤雌激活的影響

脈沖時(shí)程100μs、電場(chǎng)強(qiáng)度為1.2KV/cm時(shí)，脈沖次數(shù)并未對(duì)卵裂率、囊胚率造成顯著影響（P>0.05），結(jié)果見(jiàn)表2。電場(chǎng)強(qiáng)度1.2KV/cm、100μs、2次脈沖處理時(shí)卵裂率和囊胚率要高于1次及3次脈沖處理, 分別達(dá)到了(68.5%、26.7%)。

表2 不同脈沖次數(shù)對(duì)豬卵母細(xì)胞孤雌激活的影響

2.3 脈沖時(shí)程對(duì)豬卵母細(xì)胞孤雌激活的影響

電場(chǎng)強(qiáng)度為1.2KV/cm、脈沖次數(shù)2次，不同脈沖時(shí)程誘導(dǎo)卵母細(xì)胞激活，結(jié)果見(jiàn)表3。脈寬100μs時(shí), 孤雌胚的卵裂率及囊胚率顯著高于其它組（P<0.05）, 達(dá)到了(77.5%、33%)，但脈沖時(shí)程的進(jìn)一步增加并不能使卵母細(xì)胞激活后的發(fā)育率升高。

表3 不同脈沖時(shí)程對(duì)豬卵母細(xì)胞孤雌激活的影響

3 討 論

電刺激是一種應(yīng)用*為廣泛的卵母細(xì)胞激活方法，高壓直流電脈沖短時(shí)間作用于卵母細(xì)胞，可以使卵細(xì)胞膜上生成暫時(shí)性孔洞，細(xì)胞內(nèi)外的離子和大分子借此進(jìn)行交換，引起細(xì)胞內(nèi)游離鈣升高，從而激活卵母細(xì)胞。電脈沖引起的微孔大小受脈沖強(qiáng)度、時(shí)間和脈沖次數(shù)的影響。多數(shù)報(bào)道是以激活率和囊胚發(fā)育率為標(biāo)準(zhǔn)，本試驗(yàn)獲得了BLS細(xì)胞融合儀激活豬卵母細(xì)胞的適宜條件：1.2KV/cm、脈寬100μs的2次直流刺激，并取得了較高的卵裂率（70%左右）和囊胚發(fā)育率（30%左右），略高于潘登科等[6]用ECM2001(美國(guó))電融合儀激活卵母細(xì)胞的孤雌胚囊胚發(fā)育率20-30%，也高于劉國(guó)世等[7] 使用日本電激儀(Embryo cell fusion system，Fujira Industry Co．Ltd，Japan)激活卵母細(xì)胞的的孤雌胚囊胚發(fā)育率18.9%，高于曹勝蘭等[8]使用國(guó)產(chǎn)寧波新芝電激儀激活卵母細(xì)胞的囊胚率（21.54%）。

本研究建立并優(yōu)化了BLS細(xì)胞融合儀在豬卵母細(xì)胞孤雌激活的條件，為體細(xì)胞核移植重構(gòu)胚的融合激活提供了數(shù)據(jù)參考。*近丹麥科學(xué)家等[9]使用該儀器已經(jīng)獲得了徒手體細(xì)胞克隆豬，這些都說(shuō)明了BLS細(xì)胞融合儀作為一種便攜、微型、價(jià)廉的電激儀，在豬的胚胎工程中具有較好  的性能，將在我國(guó)的豬胚胎生物技術(shù)領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。

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The Application of BLS Cell Fusion Instrument on Porcine Parthenogenetic Activation

LIU Xiao1,2, ZHANG Qing-qiao3, Pan Deng-ke2* ,CHEN Kou-kou2,4, ZHANG Wei-hong2,4, FENG Chong2,4, FENG Shu-tang2

(1.Lanzhou Institute of Animal Science and Veterinary Pharmaceutics, Chinese Academy of Agricultural Sciences(CAAS) Lanzhou,730050;2.Institute of Animal Science, CAAS, BeiJing, 100094;3.Hebei University of Engineering,Handan,056038;4.Gansu Agricultural University, Lanzhou,730070)

Abstract: Objective To establish and optimize the electric parameters of BLS cell fusion on porcine parthenogenetic embryo, being for the cloned ones. Methods MⅡ oocytes matured in vitro were activated by electrically stimulation with different pulses and different strength and different field duration to induce parthenogenetic 
Activation and further development. Conclusions Parameter (1.2KV/cm 、100μs、2 pulses) supported Higher percentages of cleavage and blastocyst (70% and 30% or so) ; BLS fusion instrument is efficient and stable for production of
 porcine embryos in vitro.

Keywords: Porcine; Parthenogenetic activation; BLS fusion instrument